HPLC merupakan suatu instrumen kimia yang banyak digunakan di dunia industri. Alat ini digunakan untuk melakukan identifikasi suatu zat atau senyawa, memisahkannya, dan mengetahui kadarnya dalam suatu sampel yang berupa cairan.
Mengenal HPLC
https://www.hitachi-hightech.com/image/id/produk/analytical_instrument/hplc/chromaster.jpg
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau dalam bahasa
Indonesia disebut dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan
suatu metode pemisahan suatu sampel dengan media cair menggunakan tekanan
tinggi.
Kromatografi sendiri memiliki pengertian yaitu teknik
pemisahan yang berdasarkan pada perbedaan pola pergerakan diantara dua fase,
yakni fase diam dan fase gerak.
HPLC ini salah satu alat laboratorium yang
bekerja menggunakan metode fisiokimia. Alat ini banyak digunakan pada
laboratorium farmasi, kimia, makanan, limbah, maupun biologi.
HPLC digunakan secara luas pada industri farmasi.
Pada industri yang bergerak di bidang farmasi, alat ini digunakan untuk
melakukan uji kadar bahan baku, bahan antara, dan juga produk jadi.
Prinsip Kerja HPLC
HPLC bekerja dengan prinsip kromatografi. Terdapat
dua fase pada HPLC yaitu fase diam (stationary phase) dan juga fase gerak
(mobile phase). Pembeda antara HPLC dengan kromatografi lainnya yaitu
adanya tekanan tinggi pada HPLC untuk mendorong fase gerak yang mengandung
analit menuju fase diam.
Adanya dorongan atau tekanan tinggi tersebut
membantu analit untuk bergerak melewati fase diam. Fase diam pada HPLC disebut
kolom HPLC. Jika analit dilewatkan pada fase diam, maka akan terjadi interaksi
antara fase diam dengan fase gerak.
Interaksi analit di fase diam dan fase gerak
inilah yang menyebabkan proses pemisahan.
Proses pemisahan yang terjadi menggunakan HPLC berdasarkan
pada perbedaan kepolaran dari analit dan juga perbedaan kecepatan analit untuk
sampai ke detektor (waktu retensi).
Ketika analit yang digunakan lebih polar, maka ia
akan menempel pada fase yang lebih polar. Dalam hal ini jika fase diam lebih
polar, maka analit akan banyak menempel di fase diam, begitu pula sebaliknya.
Urutan skala polaritas dari golongan senyawa analit
yang digunakan yaitu golongan asam > golongan alkohol > golongan keton
> golongan ester > golongan eter > senyawa terhalogenasi > hidrokarbon
> golongan fluorocarbon
Mengenal Bagian-Bagian HPLC
Untuk mengenal HPLC lebih dalam, berikut ini adalah bagian-bagian HPLC yang dapat Anda ketahui.
Solvent Bottle
Bagian HPLC ini berfungsi untuk menampung solven
sebagai fase gerak. Bagian ini berupa botol berukuran besar yang berisi solven.
Solvent Organizer
Solvent organizer berfungsi untuk menghilangkan
pengaruh gas atau gelembung dan juga untuk mengurangi terjadinya fluktuasi
tekanan yang dapat menyebabkan base line conditioning tidak bisa
tercapai.
Pump
Pump atau pompa berfungsi untuk memberikan tekanan
pada alat HPLC sehingga dapat mendorong fase gerak yang ada di reservoir untuk
menuju kolom fase diam dan melewati detektor. Pompa yang digunakan pada HPLC
harus pompa yang memiliki tekanan tinggi.
Injector
Injector berfungsi sebagai tempat masuknya sampel ke
dalam HPLC. Proses injeksi dapat dilakukan dengan cara manual dengan menggunakan
syringe atau sistem injeksi otomatis.
Pada HPLC, injector mampu menampung sampel
cairan dengan volume berkisar antara 0.1 – 100 mL.
Sampel
Sampel atau analit yang akan dianalisis
menggunakan HPLC haru berupa cairan yang bening dan tidak memiliki endapan. Sehingga
sampel perlu dipreparasi terlebih dahulu misalnya dengan melakukan filtrasi,
desalting, dan lainnya.
Column
Kolom HPLC ini merupakan tempat terjadinya
aktivitas utama dalam HPLC. Kolom HPLC ini berperan sebagai fase diam. Proses pemisahan
komponen sampel terjadi di kolom HPLC. Masing-masing komponen dalam sampel nantinya
dapat dihitung waktu retensinya dalam detektor.
Waktu retensi sendiri yaitu waktu yang dibutuhkan
oleh senyawa komponen sampel untuk melewati kolom menuju detektor. Setiap senyawa
memiliki waktu retensi yang berbeda, sehingga masing-masing konsentrasinya
dapat dihitung.
Umumnya kolom HPLC terbuat dari silika gel yang
dimampatkan. Tipe kolom HPLC yang sering digunakan yaitu tipe kolom C18.
Detector
Detektor berguna untuk mendeteksi komponen yang telah
melewati kolom dan juga memberikan sinyal elektronik pada pengolah data. Detektor
HPLC yang paling umum yaitu detektor UV Vis. Selain itu, terdapat pula jenis
detektor lain seperti detektor fluoresensi, elektrokimia, dan indeks bias.
Pengolah Data
Output visual dari hasil analisis akan ditampilkan oleh
pengolah data dan terbaca oleh detektor dalam bentuk kromatogram. Kromatogram ini
menunjukkan jumlah komponen dalam sampel yang dilihar dari jumlah puncak (peak)
yang dihasilkan.
Untuk mengetahui konsentrasi sampel yang hendak
dianalisis, dapat dihitung dengan membandingkan luas area peak komponen
dengan luas area peak serta konsentrasi standar.
https://news.labsatu.com/wp-content/uploads/2017/01/Chromatogram-1024x659-e1494235631373.jpg
Jenis-jenis HPLC
Jenis-jenis HPLC adalah sebagai berikut
HPLC Fase Normal
Pada HPLC fase normal, pemisahannya didasarkan
pada polaritas dari fase diam dan gerak. HPLC fase normal menggunakan fase diam
yang bersifat polar dan fase gerak yang bersifat non polar.
HPLC Fase Terbalik
HPLC fase terbalik ini merupakan kebalikan dari
HPLC fase normal, dimana fase diam yang digunakan bersifat non polar dan fase gerak
yang digunakan bersifat polar. Pada HPLC fase terbalik, material non polar lebih
tertahan daripada material polar.
HPLC Pertukaran Ion
HPLC pertukaran ion digunakan untuk komponen yang
mudah terionisasi. Fase diam yang digunakan pada HPLC jenis ini bersifat asam
atau basa dengan mempunyai tegangan positif atau negatif.
Sedangkan fase gerak yang digunakan yaitu larutan
garam dalam air. Pemisahan molekul pada HPLC pertukaran ion terjadi karena
adanya persamaan/ perbedaan kekuatan ion antara sampel dengan fase diam.
Size Exclusion HPLC
HPLC ini memiliki kolom fase diam yang sangat porous
untuk membantu pemisahan sampel berdasarkan ukurannya. Kolom pada HPLC ini
dibuat dari kombinasi polimer seperti sakarida dan silika.
Itulah informasi mengenai HPLC, instrumen kimia
yang banyak digunakan di industry. Semoga bermanfaat.
0 Comments